загрузка...
загрузка...
На головну

Пектіностерази (К. Ф.3.1.1.11)

Пектінметілестерази, ПЕ (К. Ф.3.1.11) каталізіруютотщепленіе метильних груп від поліметілгалактуроновой кислоти з образованіемметанола і частково деметоксілірованной полігалактуронової кислоти.

Процес протікає згідно з наступною схемою (стрілками показано дію ферменту):

ПЕ деетеріфіцірует пектини на 60-70%. У міру зниження ступеня етерифікації субстратів зменшується спорідненість ферменту до них, і процес гідролізу не проходить до кінця. ПЕ переважно діє на великі молекули, метоксильованих олігоуроніди розщеплюються повільніше.

Пектінестераза синтезуються вищими рослинами, мікроскопічними грибами, дріжджами і бактеріями.

Пектінестераза проявляють максимальну активність в інтервалі рН 4,4-8,0, у деяких мікроскопічних грибів при рН 2,5. Оптимальна температура дії 30-40 ° С. Пектіностераза входить в комплекси пектолітіческіх ферментних препаратів мікробного походження.

Желирующая здатність пектину залежить від ступеня метоксіліро-вання або ступеня етерифікації, тому дія пектінестераза по отщеплению метоксільних груп призводить до зниження желюючий здатності і супроводжується падінням в'язкості. На цьому, очевидно, і грунтується застосування цього ферменту для освітлення плодових соків і вина.

Зазвичай комплексні препарати пектолітіческіх ферментів застосовуються для цих цілей, отримують з різних цвілевих грибів, і перш за все з A. Niger

2.2. Глікозідази (К. Ф.3.2)

Цей підклас включає близько ста ферментів з різною специфічністю дії, які здійснюють гідроліз оліго і полісахаридів; деякі ферменти цього типу здатні здійснювати трансферазную реакції - переносить гликозидні залишки на олиго- і полісахариди, нарощувати полісахаридні ланцюжки. Представники гликозидаз були одними з перших ферментів, оборотність дії яких in vitro була експериментально доведена.

Глікозідази стереоспеціфічность. Вони гідролізують Глікозидний зв'язку певної просторової конфігурації (? або ?), але не обох одночасно. Прикладами можуть служити ?-амілаза, ?-глюкозидази, глюкоамілаза, гідролізуючі виключно ?-Глікозидний зв'язку, і ?-глюканаза, целлобіза, лізоцим - гідролізуючі ?-зв'язку.

Менш строга вибірковість проявляється до різних видів ?- або ?-глікозидних зв'язків. Так, глюкоамілаза розщеплює ?-1,4 і ?-1,6-зв'язку; глюканаза бацил - ?-1,3 і ?-1,4-зв'язку;

Глікозідази специфічні щодо довжини ланцюга гідролізуемих полімерних субстратів. Так, глюкоамілаза цвілевих грибів переважно гідролізує високомолекулярні полімери ?-1,4-пов'язаної глюкози, а аналогічний фермент - ?-глюкозидази дріжджів каталізує гідроліз тієї ж зв'язку в олігосахариди, але не в крохмалі.

Ендополігалактуроназа (К. Ф.3.2.1.15) і Екзополігалактуроназа (К. Ф.3.2.1.67)

Ці ферменти, поряд з пектінестераза здійснюють гідроліз пектинових речовин.

Ендополігалактуроназа, ендо- ПГ (К. Ф.3.2.1.15) каталізує гідроліз ?-1,4-глікозидних зв'язків між неестеріфіцірованним залишками галактуроновой кислоти в різних пектинових полисахаридах. Гідроліз відбувається неврегульованим способом, переважно розщеплюються внутрішні зв'язки полімерів. При гідролізі 1-10% зв'язків в'язкість розчинів галактуронанов знижується не менше ніж на 50%

 Ендо-ПГ
 Схема гідролізу:

 Полігалактуронових кислота + Н20

 Олігогалактуроновие кислоти + моногалактуроновая кислота

Фермент розщеплює в пектин фрагменти полігалактуронової кислоти різної молекулярної маси і ступеня етерифікації. З найбільшою швидкістю гідролізуються низькоетерифікованим субстрати, такі як пектовая кислота, поліпектат натрію, буряковий пектин. Більш повільно - лимонний і яблучний пектин, а пектин Лінка (ступінь етерифікації 99%) зовсім гідролізується. При дії на олігоуроніди переважно розщеплюються субстрати більшою мірою полімеризації. Основним кінцевим продуктом гідролізу пектинів, в залежності від джерела ферменту, може бути моно-, ди-, три- або тетрагалактуроновая кислота.

Дія ендо- ПГ на рослинні тканини викликає їх мацерацию в результаті розщеплення пектинових речовин серединних пластинок. У комплексі полігалактуронази гриба Asp. alliaceus тільки ендо- ПГ практично повністю мацерированной до стану ізольованих клітин тканини картоплі, кабачка, гарбуза, яблука, сливи, груші, персика.

Більшість досліджених ендополігалактуроназ - ферменти молекулярної маси 30-80 кДа з оптимумом дії при рН від 3,5 до 6,5 і температурі близько 50 ° С. Ендо-ПГ деяких мікроскопічних і вищих грибів інгібують іони лужноземельних і важких металів.

Екзополігалактуроназа екзо- ПГ (К. Ф.3.2.1.67) каталізує розщеплення кінцевих ?-1,4-глюкозідной зв'язків між залишками неестеріфіцірованним галактуроновой кислоти в різних пектинових полисахаридах (полігалактуронової кислоті, пектати, пектин) з утворенням моногалактуроновой кислоти. Гідроліз супроводжується незначним зниженням в'язкості розчинів субстратів. Фермент розщеплює пектати неповністю, приблизно на 50%.

Частково деградовані субстрати, як правило, гідролізуються екзо- ПГ швидше високополімерних. Краща низький ступінь метоксилювання галактуронанов. Так, відносна швидкість гідролізу субстратів різного ступеня етерифікації двома формами екзо- ПГ Asp. alliaceus склала: пектовой кислоти - 98-100, бурякового пектину - 92-100, лимонного - 20-24, яблучного 1,3-7,5, сливового - 0,3-2,0.

Екзополігалактуронази мають оптимум дії при рН від 3,4 до 6,0 і температурі 30-50 ° С. Деякі грибні екзо- ПГ активуються кобальтом, відзначено зниження лужноземельними, важкими металами і ЕДТА.

Екзополігалактуронази входять до складу пектолітіческіх і цитолитических ферментних препаратів з культур мікроорганізмів (Пектаваморин, Пектофоетидин, целюлази-100, Поліканесціна, Ультразіма, Вінфлоу і ін.).

Для промислового виробництва ферментних препаратів пектолітіческіх ферментів, які є комплексними, як продуцентів використовують в основному мікроскопічні (цвілеві) гриби, зокрема, гриби роду Aspergillus: A. niger, A. wentii, A. oryzae. Бактеріальні ферменти в промислових масштабах не виробляються.

Рослинні полігалактуронази, мабуть, схожі на грибні полігалактуронази. Вони виявлені в широкому спектрі плодів і овочів: помідори, авокадо, редисці, огірках, яблуках, грушах, цитрусових та ін. Всі вони проявляють активність при природних рН плодів.

Застосування препаратів пектолітіческіх ферментів в промисловості досить широко. Вони використовуються при виробництві фруктових сокових концентратів і екстрактів, при освітленні соків і вин, при виробництві фруктових і овочевих пюре і нектарів.

Целлюлолітіческіе ферменти

Целюлоза є одним з найбільш важко гідролізуемих природних полімерів. В організмі вищих тварин і людини не синтезуються ферменти, що гідролізують целюлозу. Біодеградацію целюлози здійснюють ферменти мікроорганізмів. Мікрофлора товстого кишечника людини ферментує целюлозу овочів і фруктів повністю. Грубіша целюлоза, наприклад, що входить в препарати харчових волокон, розщеплюється на 0-70%.

У гідролізі целюлози беруть участь три основних види ферментів. Ендо-?-1,4-глюканаза (КФ3.2.1.4) каталізують невпорядковане розщеплення целюлозних молекул на великі фрагменти. При дії екзо- ?-1,4-глюканаза, або целлюлобіогідролази (К. Ф.3.2.1.91) від нередуцирующего кінця целюлозних молекул або їх ферментів отщепляется целлобиоза. Целлобіози, або ?-глюкозидази (К. Ф.3.2.1.21) каталізують гідроліз целлобіози і, з меншою швидкістю, невеликих целлоолігосахарідов, з утворенням глюкози. Деякі мікроорганізми синтезую екзо- ?-1,4-глюкозидази (КФ3.2.1.74), під дією якої від нередуцирующего кінця целюлозних субстратів отщепляется глюкоза.

Індивідуальні ендо- та екзоглюканази здатні розщеплювати нативную целюлозу, проте в природі цей процес відбувається зазвичай під дією комплексу ферментів.

Целлюлазной комплекси мікроорганізмів і вищих базидіальних грибів включають до 20 ферментних білків, серед яких, як правило є і ендо-, і екзо- ферменти.

Гідроліз целюлози асоційованими бактеріальними целюлази має місце в рубці жуйних тварин. У рубцевої рідини лише близько 5% целлюлаз знаходиться у вільному стані, решта представлена асоцоатами. У гідролізі целюлози беруть участь різні бактерії, що населяють рубець. За 6-8 год перебування в цьому відділі шлунка целюлоза розщеплюється на 40-50%.

Повнота гідролізу целюлози залежить від ряду факторів, в числі яких такі: ступінь кристалічності субстрату, величина його питомої поверхні, склад ферментативного комплексу, використовуваного для гідролізу, і властивості його компонентів.

Нативная целюлоза має дуже міцну структуру і важко гідролізується. При дослідженні гідролізу зразків целюлози різного ступеня кристалічності знайдена зворотна залежність швидкості гідролізу від відсотка кристалличности. Для збільшення доступності целюлози дії ферментів її піддають подрібнення. При цьому знижується розмір часток, збільшується питома поверхня субстрату і частка аморфної частини. При сильному механічному впливі може бути навіть знижена ступінь полімеризації целюлози. Швидкість гідролізу целюлози прямо пропорційна величині питомої поверхні, вона збільшується в міру зниження розміру часток і ступеня полімеризації целюлози.

Мікроорганізми синтезують целлюлазной комплекси, що розрізняються за здатністю гідролізувати целюлозу з високим ступенем кристалічності. Так звані «неповноцінні» комплекси добре гідролізують аморфну целюлозу, а в кристалічній целюлозі розщеплюють лише її аморфну фракцію (2-5%). Різке зниження активності «неповноцінних» комплексів по відношенню до «повноцінним» спостерігається при зростанні ступеня кристалічності субстрату до 60-70%.

Повноцінні целлюлазной комплекси обов'язково містять ендоглюканази, здатні міцно сорбироваться на субстраті.

Чим вище коефіцієнт розподілу, тим вище реальна концентрація ферменту на поверхні субстрату і швидкість гідролізу. Спостерігається пряма пропорційна залежність швидкості гідролізу кристалічного субстрату від кількості ендоглюканази, сорбированной на його поверхні

У повноцінному целлюлазной комплексі, де, як правило, присутній ендо- фермент з високою сорбційною здатністю, целлобіогідролаза може і не володіти цим властивістю. При цьому спостерігається синергізм дії целлобіогідролази і ендоглюканази: активність комплексу ферментів вище суми активностей його складових. Синергізм пояснюється тим, що ендо- фермент шляхом механохімічного впливу готує субстрат для екзо- ферменту, а також послідовністю реакцій розщеплення целюлози, що каталізують ендо- та екзоглюканазамі, за схемою:

       
 
 Ендоглюканаза
   
 Целлобіогідролаза
 


 целюлоза Целлодекстріни

 
 
 Целлобіаза


 целлобіоза Глюкоза

Синергізм дії може спостерігатися в різних комбінаціях ендо- та екзо- ферментів (ендо- ендо-, ендо- екзо, екзо- екзо), але в будь-якому випадку одна з целлюлаз значно відрізняється від іншої за здатністю адсорбуватися на субстраті. Ферменти, близькі по сорбційної здатності, при з'єднанні не проявляють синергізму. Синергетичний ефект целлюлаз значний: ступінь розщеплення субстрату збільшується в 2,5-2,8 рази.

Для гідролізу целюлози використовуються комплексні ферментні препарати, які виділяються з культур мікроскопічних грибів і актиноміцетів і володіють ендоглюканазной, целлобіогідролазной і целлобіазной активністю. Окремі компоненти целлюлазной комплексів грибів та актиноміцетів проявляють найбільшу активність при рН від 3,7 до 5,5, а комплекси в цілому - при рН 4,5-5,5. Оптимальна температура дії окремих компонентів - від 45 до 80 ° С, комплексів - 50-60 ° С. Деякі вищі базидіоміцети синтезують целюлази з оптимумом при рН З.

Багато целюлази є водневмісткої білками, вуглеводна частина може становити до 90% молекулярної маси. Вуглеводна частина виконує якірну функцію, сприяючи сорбції ферменту на субстраті. Сорбція по спорідненості необхідна, оскільки в рН-зоні активності целюлази має незначний заряд (рН-оптимум близькі до ВЕТ). Можливо, вуглеводна частина забезпечує ковзання ферменту в фібрилярних структурах целюлози. Це важливо, оскільки целюлази здійснюють сотні і тисячі каталітичних актів, не залишаючи поверхні однієї целюлозної молекули.

Вуглеводна частина целлюлаз захищає білок від дії денатуруючих агентів і від протеолізу.

Конверсія целюлози в природних біоценозах пов'язана з деструкцією геміцелюлози і лігніну. При культивуванні грибів на деревних субстратах в першу чергу розкладається геміцелюлоза, після видалення ксилана збільшується швидкість гідролізу целюлози. Ксілази і целюлази проявляють синергізм, що пояснюється послідовністю їх дії при гідролізі змішаного субстрату, де целюлоза екранована геміцелюлозою.

Застосування целлюлолитических ферментів представляє великий інтерес, т. К. Ферментативний гідроліз целлюлозосодержащих матеріалів (деревина, торф, сільськогосподарські і міські відходи) може забезпечити отримання різних біотехнологічних продуктів (глюкози, етанолу, ацетону, мікробної біомаси).

Ліпази (К. Ф.3.1.1.3) «-- попередня | наступна --» амілази
загрузка...
© om.net.ua